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一文带您了解抗体亲和层析:蛋白A、蛋白G、蛋白L
发布时间:2021/11/30 13:33:04   点击次数:4675次

 

亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。抗体与抗原、激素与受体、酶与底物等这些生物大分子之间因存在这种特异性亲和力,常常一种分子作为配基,制备成亲和层析介质,用来纯化对应的目标分子,这种方法称为亲和层析法。具体来讲,亲和层析法即是将配基固定于惰性载体上,混合物中的目标蛋白与配基特异性结合,从而被捕获,无关的杂质组分随着流动相被冲洗下来,然后选择合适的洗脱液讲目标蛋白从载体上洗脱下来,从而得到单一组分的纯化物质。
 

抗体亲和层析

 

蛋白A、蛋白G和蛋白L是科学家陆续发现能够与抗体进行特异性结合的蛋白分子。

 

图1. 抗体亲和层析示意图

 

目前蛋白A及其衍生的重组蛋白、蛋白G已广泛应用于抗体的纯化。随着我国抗体药物和免疫诊断产业的快速发展,抗体制备量将大幅提升,市场对蛋白 G、蛋白 A 的需求量会迅速增加。

 

蛋白A
蛋白A是一种来源于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,能够与免疫球蛋白特异性结合,广泛用于抗体的检测和纯化。

 

天然蛋白A结构稳定,不耐酸碱,分子内部不存在二硫键,拥有5个高度同源的区域,与IgG有结合作用。在SPA的5个结构域中,每个结构域都由58个氨基酸组成三个α反向螺旋,三维结构稳定。蛋白A与多种来源的IgG都有很强的亲和力,结合位点位于IgG的Fc段,不影响IgG结合抗原的活性。目前,以蛋白A为亲和配基的亲和层析介质已广泛应用于单克隆抗体和Fc重组融合蛋白的纯化。

 

由于层析柱在使用时,因样品中变性的蛋白、脂类、DNA等物质常残留在层析介质中,严重影响了层析介质的使用寿命,常采用0.1-0.5M的氢氧化钠进行清洗,而天然或普通的重组蛋白A对氢氧化钠并不耐受,往往导致蛋白A的变性和脱落。

 

威尼斯欢乐娱人城3788.v通过基因重组改造,开发的耐碱蛋白A拥有四个IgG功能结合域,末端带有巯基,具有高耐碱性、高亲和力的特点,可作为配基制备成耐碱蛋白A亲和层析介质。

 

图2. 耐碱蛋白A 经SDS-PAGE检测纯度>95%

 

表1.耐碱蛋白A亲和层析介质耐碱性能测试

 

蛋白A对免疫球蛋白IgG亚型的结合是有选择性的,例如在人IgG 的四种亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中,蛋白A唯独不与IgG3结合。在与IgA结合中,只与IgA2结合,不结合IgA1。蛋白A不结合禽类血清IgG。

 

蛋白G
1973 年,瑞典的科学家 Kronvall 研究发现,链球菌细胞壁表面存在能与 IgG 结合的蛋白,但是并不与 Ig A、Ig M、IgD 和 IgE 有类似的结合反应。1984 年,Bjorck等将这类蛋白统称为链球菌蛋白 G。

 

蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞壁蛋白,分子量25kDa,为三型Fc受体。蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合,与蛋白A相比对IgG具有更好的结合能力,血清蛋白结合水平更低,纯度更高,配基脱落也相对更低。天然的蛋白 G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、α2-巨球蛋白相结合,这使得用蛋白G亲和色谱提纯抗体,无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。

 

蛋白G的免疫球蛋白结合区域主要与IgG的 Fc片段作用,该区域含有C1、C2、C3 三个由 55 个氨基酸组成的单结构域,分别被16个氨基酸组成的间隔区域 D1、D2分隔开,每一个单结构域都能够与抗体IgG的Fc片段结合。

 

 

图3. 链球菌蛋白G的结构

 

威尼斯欢乐娱人城3788.v开发的重组蛋白G含有三个与Fc结合的结构域,已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点,减少了交叉反应和非特异性结合。

图4. 蛋白G经SDS-PAGE检测纯度>95%

 

表2.蛋白G偶联柱料抗体载量

 

重组蛋白G具有广泛的结合谱,可与人、牛、兔、山羊、大鼠和小鼠的多克隆抗体结合,并且可结合小鼠 IgG1、IgG2a 和 IgG3 还有大鼠 IgG2a、IgG2b 和 IgG2c等单克隆抗体。重组蛋白G几乎可与所有哺乳动物IgG结合,只是亲和力强弱有所不同。

 

蛋白L
蛋白L是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白特异性结合的蛋白质,分子量36 kD。与蛋白A和蛋白G结合到(抗体)的Fc区不同的是,蛋白L能够结合那些含有κ轻链的抗体,结合位点位于蛋白L N端的五个小的同源结构域。这些结构域的三维结构与蛋白质G结构域非常相似,尽管蛋白质G和L没有显著的序列同源性。

 

蛋白L能够结合IgG、IgM、IgA、IgE和IgD,还可以结合单链抗体ScFv和Fab。与蛋白A和蛋白G相比,蛋白L更能广泛地结合各种来源及亚类的抗体,包括人、小鼠、大鼠、兔和鸡,但不结合牛、山羊或绵羊来源的免疫球蛋白。

 

威尼斯欢乐娱人城3788.v开发的重组蛋白L,既保留了与抗体κ链结合的特性,同时也不会影响抗体的抗原结合位点。

 

附表:Protein A、Protein G、Protein L结合抗体能力比较

 

注:+: 表示结合能力, + 越多, 结合能力越强;  -: 表示不结合;  N/A: 无数据

 

 

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